【汇总】粪便微生物群落研究的样品保存方法

本文转自生物谷！

在过去十年左右，研究人员已花费几十亿美元对栖息于不同地点（如人体、土壤和海洋）中的微生物进行分门别类。对这些不同的微生物组，我们所知的大多数信息都是通过日益复杂的下一代测序技术获得的。比如，科学家们通常对编码16S rRNA---细菌核糖体小亚基中的一种组分---的基因进行高通量测序来测量样品中的微生物多样性。当研究人员想要对样品内所有有机体中的所有基因都进行测序时，那么鸟枪法宏基因组（shotgun metagenomics）是一种用于微生物组研究的配套技术。这些DNA测序技术非常灵敏，能够区分污染或者危害的样品处理导致的细微变化。

因为样品处理和储存上存在的差异能够影响一项研究的结果，所以维持现场收集到的样品的完整性是微生物组研究所面临的一项重大挑战。位于美国明尼苏达州罗切斯特市的梅约诊断博士后研究员、微生物学生态学家Vanessa Hale说，金标准方法就是立即抽取新鲜样品中DNA或RNA。当立即处理不可行时，最好的方法就是将样品储存在−80 °C下。粪便样品中的微生物组成在室温放置一到两天后就开始发生变化（参照文献1和2）；其他的样品，如土壤，也具有类似的温度敏感性。然而，获取一种超低温冷藏箱（ultra-low-temperature freezer）并不总是可能的。比如，研究对象可能需要在家收集粪便样品，或者研究人员可能在偏远地点收集土壤样品。在一些情形下，在对DNA和RNA进行提取和分析之前，必须将样品储存和保藏数天或数周。

美国芝加哥大学微生物生态学家Jack Gilbert说，“微生物组是如此多样性和复杂。你做的任何一种特定事情都将改变[它的]一部分。”随着技术允许对微生物环境进行更加深入的研究，即便微生物群体的存在或相对丰度发生最为微小的变化，也能够显著干扰群体比较。一种储存方法所导致的变化越少，结果就越好。

《科学家》杂志与微生物组专家进行沟通，让读者了解如何储存样品同时保存它们的微生物多样性。

1.确保样品均质化

维持原始样品的保真度开始于收集的那一刻。第一步就是确保拥有均质性的样品。比利时根特大学微生物学家Kim Heylen说，“如果样品没有均质化，那就让它均质化。如果想要拥有可以复制的二次抽样样品（subsample），[这样做]是至关重要的。”

美国加州大学戴维斯分校微生物学家、博士后研究员Holly Ganz在一家非盈利机构KittyBiome开始职业生涯，其中该非盈利机构研究野猫和家猫的微生物组，研究对象通常为它们的粪便样品。Ganz说，“粪便并不是均质性的。它存在一个问题：以粪便中哪一部分为样品将影响研究结果。” Ganz首先移除粪便的外层，这是因为外层可能含有环境污染物，接着将粪便剩余部分放入塑料袋中以便一起磨碎和混合。接下来，她将样品沿着薄板铺展开来，并且从中二次抽样样品。她说，“让粪便均质化是非常困难的，因此我只是增加我获取二次抽样样品的次数。”

在最近对人肠道微生物组的研究中，研究人员利用研钵及研杵捣碎加有液氮的粪便样品，然后将形成的粉末分配成较少的样品，转移到试管中，然后在−80 °C下冻存。相比于来自未均质化的新鲜样品的二次抽样样品，利用这种方法制备的样品在微生物组成上表现出减少的变化（参照文献3）。

土壤具有更加复杂的基质。Gilbert建议将土壤样品放入搅拌机中尽可能地搅碎颗粒物。他说，“完全均质化是不可能的。”

研究人员也建议在初次收集样品后，进行多次重复地等分，这是因为多次冻融循环破坏核酸质量。比如，科学家们使用无菌的一次性活检钳（biopsy punch）从一个更大的原始样品中收集几乎相同大小的冻存粪便颗粒。然后，直接将这些颗粒放入含有核酸裂解液中的提取管中。这种方法仅仅通过对原始的样品进行等分，为科学家们节省整整一次冻融循环。

2.应当使用一种低温保存剂？如果应当，那么使用哪种？

低温保存剂（cryopreservant）---在给定样品中让核酸保持稳定的缓冲液---提供低技术的冷藏液。低温冻存让细胞免受冻结温度下的冰块形成和温度波动导致的机械损伤。

使用哪种低温保存剂主要依赖于计划如何使用样品。如果想要培养细菌或者需要让它们活着，那么可能使用甘油，它阻止冰晶在低至−20 °C～−80 °C的温度下形成。位于美国马萨诸塞州梅德福市的非盈利性粪便库OpenBiome收集来自健康人的粪便样品来治疗感染上艰难梭菌（Clostridium difficile）的病人。OpenBiome质量经理Daniel Blackler说，鉴于粪便移植治疗的成功依赖于拥有活的细菌，因此将粪便样品与含有12.5%甘油的盐溶液混合，然后在−20 °C下可储存长达6个月，在−80 °C下可储存长达2年。

如果研究人员只是计划研究核酸组成，那么他们有更多选择。对这种类型的研究而言，在储存之前，将样品加入到一种裂解液中。尽管很少有研究比较了不同低温保存剂在维持原始样品多样性上的影响，但是已有证据提示着低温保存剂能够在不同程度上影响不同微生物物种的存在（参照文献4）。Hale建议道，“关键在于针对自己的研究，选择一种可行的和合适的方法，同时也意识到它的潜在差错。”

总体而言，研究人员发现加入一种低温保存剂有益于人类样品。Ganz注意到，在比较储存的样品和新鲜样品的微生物组成之前，一种快速地评价低温保存取得成功的方法是看一下DNA产量。她说，“如果不能获得足够的DNA，那么就不能足够好地代表[样品中的]微生物组。”

2.1 二甲基亚砜+海藻糖+胰酪大豆胨液体培养基
Heylen使用二甲基亚砜（DMSO）溶液、海藻糖和胰酪大豆胨液体培养基（Tryptic Soy Broth， TSB），从而有助维持三种微生物组系统中冷冻样品的保真度（参照文献5）。Heylen说，“海藻糖阻止细胞干燥，而TSB也是一种低温保存剂。”她建议先将这种溶液放置在大约4 °C下，然后将它加入到即将放入一种超低温度冷藏箱内的样品中。“如果没有−80 °C冷藏箱的话，那么也能够使用家用冷藏箱。但是肯定要尽可能快地冻存样品，而且在没有一种低温保存剂的存在下不要冻存。”

2.2 保存剂RNAlater
起初开发出来是作为一种RNA保存剂使用的，RNAlater是一种无毒的水溶液，由诸如Qiagen公司（50mL的78美元，250mL的324美元）和Thermo Fisher公司（100mL的125美元；500mL的386美元）之类的制造商销售，也能够被用来保存DNA。在与人类微生物组项目（Human Microbiome Project）合作时，哈佛大学陈曾熙公共卫生学院（Harvard T.H.Chan School of Public Health）计算生物学家Curtis Huttenhower和他的同事们发现在样品收集后，如果没有冷藏箱可供使用的话，那么加入这种保存剂也能够起作用。

但是RNAlater也具有一些用户报道的缺陷。尽管它没有可燃性的事实使得这种保存剂成为一种用于样品运输的合适选择，但是相比于新鲜提取的样品，它显著地降低拟杆菌门（Bacteroidetes）细菌和瘤胃菌科（Ruminococcaceae）细菌群体。Ganz建议道，“RNAlater阻止样品正常地形成颗粒沉淀，因此在移除RNAlater之后，不得不再次利用磷酸盐缓冲液清洗这种沉淀。”

根据美国伍兹霍尔海洋研究所海洋生物化学家Mak Saito的说法，RNAlater的另一个潜在问题是它的高盐含量，这对一些医学实验程序而言，进行样品处理也令人头疼。Saito利用这种溶液协助保存海洋微生物组中的蛋白组成（参照文献6）。

2.3 乙醇
相对于RNAlater而言，乙醇是一种更加便宜的替代性选择，而且已证实它在八周多的时间内稳定地保存粪便样品中的微生物群落结构，即便是在室温下，也是如此（参照文献4）。然而，乙醇是可燃的，因此它不能用于样品运输之中。更重要的是，相对于新鲜收集并进行分析的样品，利用乙醇进行的低温保存导致蓝藻细菌（Cyanobacteria）数量增加。Ganz说，“所有这些储存方法都会带来偏差，因此研究中总是使用同一种方法是较为重要的。” Ganz是在接受储存蜘蛛猴粪便的同事们的建议之后，将她收集的猫粪便样品保存在70%乙醇中。

2.4 不使用低温保存剂
对一些类型的样品而言，加入一种低温保存剂会改变微生物组成太多而不值得。Gilbert说，土壤就是这种情形。他建议在−80 °C下冻存土壤样品48小时。他说，“我们想要在收集这种样品时就看看它的微生物群落组成和结构。”在土壤样品非常潮湿的环境中，Gilbert推荐立即冻存它们，这是因为高水分含量能够导致某些类型的细菌增殖。

对粪便样品而言，有时低温冻存也并不合适。Blackler说，比如，用于治疗艰难梭菌感染的粪便样品能够在室温下保存长达6个小时，同时不会导致治疗质量发生显著变化。

3.其他的温度考虑因素

微生物组样品对冻融循环非常敏感。Hale说，“解冻能够导致微生物组样品产生严重偏差。在每个冻融循环期间，DNA都会降解，而且当样品解冻时，污染和微生物大量生长的情形也能够发生，此外，挥发性化合物丢失并且不能回收用于潜在的代谢组学分析。”

如果只有−20 °C冷藏箱可供使用，那么这种冷藏箱最好只用于储存微生物组样品。Heylen说，“如果−20 °C冷藏箱持续打开，那么温度能够发生变化，这会使得储存成功率显著下降。”

在OpenBiome，研究人员在将样品转移到−80 °C下储存更长时间之前，让它们在−20 °C下持续冻存长达6个月。Blackler说，将样品转移到超低温冷藏箱中应当不会对微生物产生负面影响。然而，“温度突然上升应当尽可能地避免，因为这会影响微生物群落。”

点击左下角的“阅读原文”可以获得参考文献。

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